Все об увеличении микроскопа. Микроскопия сверхвысокого разрешения

к. т. н. Егорова О.В.,
эксперт Госстандарта РФ по оптическим приборам

Микроскоп является одним из основных приборов при проведении цитологических исследований. Качество его работы, как сложной оптической системы, определяется технологическими особенностями прибора и его элементов. Качество же изображения в первую очередь определяется природой построения изображения препарата световым потоком, прошедшим через него. По теории образования изображения в микроскопе, созданной на предприятии Карла Цейсса математиком и физиком Эрнстом Аббе (1840-1905) [показать] в 1872 году, изображение является совокупностью дифракционного и интерференционного свойства света.

2005 год объявлен годом Аббе за вклад в развитие оптического приборостроения и за организацию Фонда "Carl ZEISS", объединившего приборостроительный завод "Zeiss" и завод по производству стекла "Schott".

Оба эти свойства влияют на качество изображения и на точность воспроизведения объекта в изображении, а Август Келер (1866-1948) в 1883 году опубликовал предписания по правильному освещению микроскопических препаратов.

С другой стороны, качество изображения оптической системы зависит и от ее технологического совершенства (наличия остаточных аберраций - искажений, дефектов стекла), сборки и центрировки.

Важной количественной характеристикой качества изображения служит разрешающая способность. Остаточные искажения вызывают перераспределение световой энергии в дифракционной картине, а внутренние дефекты объектива (и всей оптической системы микроскопа) приводят к образованию вредного рассеянного света и геометрического искажения дифракционной картины, накладывающихся на оптическое изображение, что снижает разрешающую способность и контраст изображения.

Разрешающей способностью оптической системы называется ее свойство изображать раздельно две точки или две линии, расположенные в пространстве предметов. Мерой разрешающей способности служит наименьшее линейное или угловое расстояние между двумя точками (линиями), изображения которых раздельно строятся оптической системой.

Оптическую систему принято считать совершенной, если разрешающая способность ограничена только дифракцией света на краях оправы объектива или апертурной диафрагмы конденсора. Дифракция света, обусловленная волновой природой света, нарушает прямолинейное распространение света; светящаяся точка изображается в виде круглого пятна, называемого кружком Эри, окруженного темными и светлыми кольцами убывающей яркости. Около 84% световой энергии сконцентрировано в центральном пятне, 7% - внутри первого светлого пятна и 9% - в остальных кольцах. Радиус р (рис. 1) первого темного кольца в плоскости изображения определяется выражением р = 1,22λ f , / D (1), где λ - длина волны света; f , - фокусное расстояние оптической системы; D - диаметр действующего отверстия системы (апертуры).

Величина р равна расстоянию между центрами изображения двух точек А и В; р можно определить по формуле р = 0,61λ / sin σ , , (2), где σ , - апертурный угол в пространстве изображений.

При λ = 0,560 мкм = 560 нм р = 0,34 / σ , где р измеряется в микрометрах.

Изображения двух светящихся точек, построенные оптической системой, представляют собой два пятна с нерезкими краями. По мере сближения точек пятна соприкасаются, потом перекрываются и затем сливаются (рис. 1).

Глаз может видеть две точки в плоскости изображения раздельно при некотором минимальном расстоянии р между ними и необходимой разности освещенностей в точке минимума а и максимумов А или В. Контрастная чувствительность для среднего глаза равна 5%. Отношение освещенности в точке а к освещенности в точке А или В достигает 85%.

Разрешающую способность оптических систем определяют с помощью штриховых или радиальных мир, выполненных на стеклянных пластинках (рис. 2). На темном фоне фотолитографическим способом нанесены светлые штрихи или сектора. Выпускают стандартные штриховые миры шести номеров (для оценки разрешающей способности объективов фотоаппаратов и других оптических приборов и узлов) и миру № 0 для автоколлимационной оценки разрешающей способности объективов микроскопа. Каждая мира состоит из 25 элементов, оцифрованных по краям и имеющих по четыре группы штрихов с шириной штриха, меняющейся от одного элемента к другому. Под шириной штриха понимают осевое расстояние между двумя соседними темными или светлыми полосами, т. е. суммарная ширина темной и светлой полос равна ширине одного штриха. Все стандартные миры имеют абсолютный контраст К = 1.

Разрешающую способность объектива микроскопа определяют в линейной мере. Для несамосветящихся объектов предел разрешения d = λ / A (3), где А - числовая апертура, равная произведению показателя преломления п среды между объективом и предметом и sin σ .

При наблюдении периодической структуры наименьшее расстояние d , согласно теории Аббе, зависит от апертуры объектива и апертуры конденсора: d = λ / (A + A k) , (4), где A k - числовая апертура конденсора.

Если апертура конденсора равна апертуре объектива, то разрешающая способность микроскопа для самосветящихся объектов определяется формулой d = λ / (2A) (5)

Следует отметить, что чем более тонкие исследования проводятся, тем более сопоставимым должно быть расчетное качество объектива и конденсора (осветительной системы). Например, новые исследовательские и универсальные микроскопы "Axio Imager" имеют принципиальный расчет IC2S оптики, уравнивающий качество объектива и осветительной системы.

Из приведенных формул следует, что чем короче длина волны света и больше апертура объектива, тем выше разрешающая способность объектива микроскопа.

Для увеличения разрешающей способности микроскопа можно использовать иммерсионные жидкости, которые заполняют пространство между рассматриваемым предметом и объективом микроскопа. Благодаря этому числовая апертура объектива микроскопа может быть доведена до 1,45, а предельное разрешаемое расстояние при λ = 0,56 мкм - до d = 0,17 мкм.

На повышение разрешающей способности влияет соотношение светового потока, прошедшего через препарат (апертура конденсора) и воспринятого объективом (апертура объектива). Если препарат контрастный (после проведенной обработки и окраски соответствующим способом), то по принципу Келера при настройке освещения допустимо раскрытие апертурной диафрагмы конденсора до величины числовой апертуры объектива или с помощью ирисовой диафрагмы размер апертурной диафрагмы конденсора может быть уменьшен на 1/3.

Таким образом, величина разрешающей способности может быть рассчитана как по формуле (5), так и по формуле (2) соответственно. Поэтому при работе с объективом А = 1,25 можно применять конденсор как с числовой апертурой А = 0,9 (сухой, разрешающая способность рассчитывается по формуле 2), так и А = 1,25 (иммерсионный, разрешающая способность рассчитывается по формуле 5), при этом не забываем, что для получения А = 1,25 на конденсор необходимо "капать" иммерсионное масло.

В табл. 1 представлены расчетные значения разрешающей способности объективов, традиционно применяемых для медико-биологических исследований.

На рис. 3 представлены примеры изображений при правильно настроенном микроскопе (а) и при неправильной настройке осветительной системы микроскопа (б, в). Как видно, неправильная настройка влияет на разрешающую способность микроскопа, а также на точность передачи элементов препарата в его изображении.

Как уже было сказано, разрешение может быть повышено за счет применения цветных светофильтров. Традиционными являются синий, зеленый, желтый и красный. Однако если синий и зеленый действительно влияют на повышение разрешающей способности, то желтый и красный работают на повышение контраста, т. е. усиливают разницу между средой и препаратом.

Таким образом, на разрешающую способность в микроскопе влияют:

• параметры объектива (числовая апертура объектива);
• возможность настройки освещения по Келеру (регулируемые полевая и апертурная диафрагмы, фокусировочное перемещение конденсора и возможность его центрировки, возможность центрировки нити лампы, если лампа не является самоцентрируемой);
• качество оптики микроскопа (расчетное и технологическое);
• применение светофильтров в коротковолновой области спектра (от УФ до зеленой).

Источник : И.П. Шабалова, Т.В.Джангирова, Н.Н.Волченко, К.К.Пугачев. Цитологический атлас: Диагностика заболеваний молочной железы.- М.-Тверь: ООО "Издательство "Триада", 2005

Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (,где n – показатель преломления среды, α –угол падения света ). Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива (заполняя пространство между рассматриваемым предметом и объективом иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат (УФ-, рентгеновское излучение).

7. Микроскопия темного поля

Для микроскопии в темном поле при­меняются особые конденсоры, у которых центральная часть линзы за­темнена, за исключением узкой полоски по периферии. При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой.

Преимущество микроскопии в темном поле зрения состоит в том, что при этом можно видеть объекты более мелкие. Кроме того, в тем­ном поле зрения лучше наблюдать в живом состоянии такие микробы, как лептоспиры, которые в водной среде не преломляют света и поэто­му в проходящем свете совершенно прозрачны. Основным ограничивающим фактором метода является то, что только малая часть падающего света в итоге формирует изображение, поэтому необходимо применять достаточно мощные источники света, что иногда приводит к повреждениям образца (сейчас иногда используют лазеры). Значительное ограничение метод накладывает на разрешающую способность системы - апертура объективов, работающих по методу темного поля существенно ниже светлопольных, так как она не должна перекрывать затемненную часть апертуры конденсора. Применение : Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов - простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток. Темнопольная микроскопия в последнее время используется в производстве компьютерных мышей с тем чтобы обеспечить работу оптических мышей в том числе и на прозрачных стёклах, имеющих микроскопические дефекты или пыль на поверхности.

8) Ближнепольная оптическая микроскопия - оптическая микроскопия, обеспечивающая разрешение лучшее, чем у обычного оптического микроскопа. Повышение разрешения БОМа достигается детектированием рассеяния света от изучаемого объекта на расстояниях меньших, чем длина волны света. В случае, если зонд (детектор) микроскопа ближнего поля снабжен устройством пространственного сканирования, то такой прибор называют сканирующим оптическим микроскопом ближнего поля. Такой микроскоп позволяет получать растровые изображения поверхностей и объектов с разрешением ниже дифракционного предела. Зондом служит оптический волновод (световолокно), сужающийся на том конце, который обращен к образцу, до диаметра меньше длины волны света. Световая волна при этом не выходит из волновода на большое расстояние, а лишь слегка “вываливается” из его кончика. На другом конце волновода установлены лазер и приемник отраженного от свободного торца света. При малом расстоянии между исследуемой поверхностью и кончиком зонда амплитуда и фаза отраженной световой волны меняются, что и служит сигналом, используемым при построении трехмерного изображения поверхности.

Если заставить свет пройти через диафрагму диаметром 50-100 нм и приблизить ее на расстояние несколько десятков нанометров к поверхности исследуемого образца, то, перемещая такой «источник света» по поверхности от точки к точке (и обладая достаточно чувствительным детектором), можно исследовать оптические свойства данного образца в локальной области, соответствующей размеру отверстия.

Именно так устроен сканирующий ближнепольный оптический микроскоп (СБОМ). Роль отверстия (субволновой диафрагмы) обычно выполняет оптоволокно, один конец которого заострен и покрыт тонким слоем металла, везде, кроме небольшой области на самом кончике острия (диаметр «незапыленной» области как раз составляет 50-100 нм). С другого конца в такой световод поступает свет от лазера.

Схема устройства ближнепольного оптического микроскопа

С помощью СБОМ можно изучать оптические явления с пространственным разрешением 30-50 нм. Отличительной особенностью СБОМ является принципиальная необходимость работать с очень слабыми сигналами.

Рисунок 1. Дифракционный предел. А. Изображение точечного источника света, сформированное оптической системой микроскопа. На центральный максимум приходится приблизительно 85% интенсивности от всех частей изображения. Б. Точечные источники света, расположенные на различном расстоянии друг от друга. Расстояние между источниками 1 и 2 значительно больше d (дифракционного предела). Расстояние между 3 и 4 равно d/2, а между 5 и 6 значительно меньше d/2. В. Изображения двух точечных источников света, полученные объективами с одинаковыми числовыми апертурами (то есть, с одинаковым разрешением), но дающие различное увеличение. Расстояние между источниками составляет d/2. Очевидно, что дополнительное увеличение не позволяет получить более четкую картину. Изображение: журнал «Квант».

Рисунок 2. Основные параметры, определяющие разрешение объектива: n - коэффициент преломления иммерсионной жидкости и α - апертурный угол объектива.

Технические хитрости

Очевидно, что такого разрешения недостаточно для детального изучения структуры и процессов, происходящих на субклеточном уровне. Так, например, размеры рибосом, ядерных пор, АТФ-синтаз, клеточных филаментов, микротрубочек и других надмолекулярных структур не превышают 150 нм. Толщина биологических мембран составляет не более 10 нм. Электронная микроскопия позволяет достигнуть необходимого разрешения, но она не пригодна для работы с живыми клетками из-за высокой разрушающей и ионизационной способности, а также предполагает напыление тонких слоев металла или углерода, что может изменить исходные свойства объекта. Атомно-силовая микроскопия* «близорука» и не позволяет проникнуть вглубь объекта более чем на 10–20 нм.

* - Взамен атомно-силовая микроскопия, конечно, обладает другими уникальными свойствами: « ». - Ред.

Важной особенностью живых клеток и тканей является низкий контраст внутренних структур, которые в основном прозрачны. Для их идентификации необходимо специфическое окрашивание, в том числе с применением различных флуорофоров* (органических молекул, флуоресцентных белков или квантовых точек). Таким образом, флуоресцентная микроскопия сочетает в себе сразу несколько преимуществ. Во-первых, возможность прижизненного изучения объектов и наблюдения процессов в реальном времени. Во-вторых, возможность специфического мечения тканей, клеток, органелл и отдельных молекул. В-третьих, доступное на данный момент разнообразие флуоресцентных красителей и белков позволяет изучать одновременно несколько мишеней .

* - Общая концепция применения флуоресцентных методов в молекулярно-биологических исследованиях изложена в статье « ». На сайте Института биоорганической химии РАН можно посмотреть видеозаписи трех докладов, объединенных общей темой «Флуорофоры: органические, неорганические и генетически кодируемые ». - Ред.

Существует достаточно много технологий, основанных на различных физических феноменах, позволяющих увеличить разрешение как в латеральном, так и аксиальном направлениях. Ближнепольная сканирующая микроскопия (микроскопия без использования линз) преодолевает дифракционный предел (разрешение порядка 20–50 нм), но позволяет изучать только поверхностные свойства объекта . Однако биологические объекты трехмерны, и с увеличением толщины объекта свет от разных слоев будет затруднять интерпретацию изображения конкретного оптического среза. Известно несколько методов микроскопии дальнего поля, значимость которых в первую очередь определяется заметным улучшением разрешения вдоль оси Z.

В конфокальном микроскопе применяется апертура в фокальной плоскости объектива, пропускающая свет только от объектов, находящихся в фокусе . Мультифотонная микроскопия основана на возможности двухфотонного или трехфотонного возбуждения флуоресценции. Например, флуорофор, обычно поглощающий ультрафиолетовое излучение (≈350 нм), может быть возбужден двумя красными фотонами (≈700 нм), если они достигли флуорофора одновременно (поглощение будет зависеть от квадрата интенсивности возбуждающего излучения). Это значит, что необходима высокая плотность фотонов для возбуждения флуоресценции. Достаточная плотность достигается в фокусе, поэтому возбуждение флуоресценции происходит только в фокальной плоскости . В I 5 M- и 4Pi-микроскопии применяются два объектива для возбуждения и/или регистрации флуоресценции, что позволяет освещать и регистрировать флуоресценцию с двух сторон от образца и заметно увеличить разрешение вдоль оптической оси (до 100 нм) .

Еще одним интересным методом является микроскопия структурированного освещения - SIM (S tructured I llumination M icroscopy). В плоскости, сопряженной с фокальной, располагается решетка, создающая определенный паттерн освещения. Индуцируемая флуоресценция повторяет паттерн освещения, при этом флуоресценция объектов, расположенных в фокальной плоскости, сильно меняется при перемещении этого паттерна. Флуоресценция объектов, расположенных не в фокусе, от сдвига решетки практически не зависит. Последующая компьютерная обработка позволяет отсечь флуоресценцию от остальных оптических слоев и также улучшить разрешение вдоль оси Z (рис. 3). В HR-SIM (High Resolution SIM) на образец проецируется освещение, характеризующееся высокой периодичностью. При взаимодействии с неизвестной структурой объекта, получается изображение с периодом выше, чем у двух изначально взаимодействующих образцов решетки и исследуемого объекта (эффект муара). Несколько раз изменяя положение решетки и анализируя различные изображения с муаровым эффектом, можно воссоздать исходную структуру объекта, недоступную обычной микроскопии из-за дифракционного предела .

Рисунок 3. Микроскопия структурированного освещения. На трех исходных изображениях (A-C) видно, что при перемещении решетки (обозначено черной линией) интенсивность флуоресценции объектов, расположенных в фокусе, заметно меняется. Флуоресценция, исходящая от других оптических слоев, практически не меняется (обозначено белой стрелкой), что позволяет избавиться от нее за счет компьютерной обработки (D).

Все перечисленные выше методы не преодолевают дифракционный предел как таковой. Сочетая сразу несколько из них, вдоль осей XYZ возможно увеличить разрешение максимум в два раза, но оно по-прежнему будет зависеть от λ и α .

Микроскопия сверхвысокого разрешения

Таким образом, из-за дифракции вместо точечного изображения флуорофора получается размытое пятно. Однако дифракция не препятствует более точному определению координат данного флуорофора, если в его окрестности не находятся другие источники флуоресценции. Если флуоресцентные молекулы можно обратимо переводить из флуоресцентного состояния А в темновое состояние В так, чтобы молекулы в состоянии А были окружены молекулами в состоянии В, координаты молекул в состоянии А можно определить достаточно точно. Последовательно регистрируя некоторый пул молекул в состоянии А и запоминая в каждом считывании их координаты, из этих данных можно реконструировать изображение с субдифракционным разрешением .

Один из способов определить точное положение флуоресцирующих молекул в некоторой точке - целенаправленно перевести флуорофоры вокруг этой точки в темновое состояние . Данный подход реализован в группе методов RESOLFT (RE versible S aturable O pticaL F luorescence T ransitions), объединяющей несколько похожих концепций . Первая практически реализованная из них - это микроскопия STED* (ST imulated E mission D epletion , метод подавления спонтанного испускания), основанная на подавлении эмиссии флуорофоров, расположенных вне центра возбуждения. Когда флуорофор находится в возбужденном состоянии А и встречает фотон с энергией, соответствующей разнице энергий между возбужденным и основным состоянием В, он возвращается в основное состояние до того, как произойдет спонтанная флуоресценция (рис. 4А ). Для вынужденной эмиссии флуорофоры освещаются кроме возбуждающего света STED-лазером с особым пространственным распределением интенсивностей в виде «пончика» с нулевой интенсивностью в центре. В результате флуоресцируют только молекулы, расположенные близко к области с нулевой интенсивностью STED-лазера, что сужает размер функции рассеяния точки (рис. 4Б,В ). Далее последовательно происходит сканирование всего образца (рис. 5) .

* - О применении STED-микроскопии для изучения субмикроскопических неоднородностей в липидных мембранах клеток и визуализации распределения некоторых мембранных белков между жидкокристаллической и «рафтовой» фазами мембраны мы писали в статье « ». - Ред.

Рисунок 4. STED-микроскопия. А. Процесс вынужденной и спонтанной эмиссии. Когда флуорофор поглощает фотон возбуждающего света, он переходит из основного состояния S 0 в возбужденное S 1 . Спонтанная эмиссия происходит, когда флуорофор возвращается в основное состояние. Вынужденная эмиссия происходит, если флуорофор поглощает фотон с энергией, сравнимой с разницей между основным и возбужденным состоянием. Б. Схематическое изображение STED-микроскопа: свет от возбуждающего и STED-лазера одновременно фокусируются на одном участке образца. В. Распределение интенсивностей возбуждающего лазера и STED-лазера, который подавляет спонтанную флуоресценцию вокруг нулевой точки. В результате сужается функция рассеяния точки .

Метод STED позволят получить субдифракционное разрешение, рассчитываемое по формуле

где I max - применяемая интенсивность STED-лазера, I sat - интенсивность, которая необходима для 50% вынужденной эмиссии. Увеличение I max до высоких значений способствует быстрому фотовыцветанию образца, поэтому для увеличения разрешения можно уменьшить I sat , которая обратно пропорциональна времени жизни флуорофора. Для этого можно изменить природу флуоресцентного состояния А и темнового В . В методе STED S 0 - основное, а S 1 - возбужденное флуоресцентное состояние. В других методах переход из флуоресцентого состояния в темновое может представлять фотохимическую реакцию с цис -транс изомеризацией хромофора флуоресцентного белка или переход между флуоресцентным и триплетным состояниями флуорофора .

Принципиально другой подход основан на последовательной стохастической активации флуорофоров. Если за каждый раунд активации небольшое число флуорофоров переходит в флуоресцентное состояние А, и при этом интенсивность света подобрана таким образом, что активированные флуорофоры находятся на расстоянии примерно 200 нм, то положение каждого флуорофора можно определить с точностью до 1 нм. Далее активированные флуорофоры «выключают».

Многократное повторение циклов активации позволяет реконструировать изображении со сверхвысоким разрешением (рис. 5), где х - точность локализации (параметр, соответствующий разрешению в традиционной микроскопии), k 1 и k 2 определяются длиной волны возбуждаемого света, нумерической апертурой объектива и размерами пикселя, b - уровень шума на пиксель и N - число испущенных фотонов. Исходя из формулы, для данного типа микроскопии предпочтительны яркие флуорофоры с высоким коэффициентом экстинкции и квантовым выходом .

Идея случайной последовательной активации флуорофоров лежит в основе методов STORM (ST ochastic O ptical R econstruction M icroscopy), PALM (P hotoA ctivated L ocalization M icroscopy), и FPALM (F luorescence P hotoA ctivation L ocalization M icroscopy), разработанных тремя независимыми лабораториями .

Рисунок 5. Две стратегии получения изображений со сверхвысоким разрешением. При направленном считывании данных (А ) каждая точка образца облучается светом с особым распределением интенсивностей, так что все молекулы вокруг данной точки оказываются в темновом состоянии. Это уменьшает размеры участка с молекулами во флуоресцентном состоянии и, следовательно, функцию рассеяния точки. Для увеличения скорости сканирования образца можно применить распределение интенсивностей в виде линий с максимумами и нулевыми значениями (правый нижний угол). Для высокого разрешения по всем направлениям необходимо несколько раз повернуть паттерн освещения. При стохастическом считывании данных (Б ) индивидуальные молекулы переключаются между флуоресцентным и темновым состоянием. Интенсивность возбуждающего света подобрана так, что флуоресцирующие молекулы окружены молекулами в темновом состоянии. Если флуорофор яркий, можно очень точно определить его локализацию. С. Сравнение изображений, полученных с помощью оптической микроскопии и технологий сверхвысокого разрешения: слева - меченный антителами виментин, справа - микротрубочки (зеленые) и пероксисомы (красные) в клетках млекопитающих .

Рисунок 6. Принцип микроскопии 3D-STORM. Трехмерная локализация индивидуальных флуорофоров с использованием цилиндрических линз. На диаграмме справа показано, как связаны эллиптичность изображения флуорофора и его Z-координата .

При изучении 3D-структуры биологических объектов для построения изображения применяют слабые цилиндрические линзы. У таких линз фокальные плоскости в направлениях X и Y немного отличаются. Таким образом, эллиптичность и ориентация изображения флуорофора зависит от его положения по оси Z. Когда флуорофор находится в средней фокальной плоскости (примерно посередине между фокальными плоскостями для латеральных направлений X и Y), то функция рассеяния точки изодиаметрична (имеет одинаковую длину по осям X и Y). Когда флуорофор расположен выше фокальной плоскости, изображение более сфокусировано вдоль оси Y, чем оси X, поэтому оно выглядит не круглым, как в предыдущем случае, а овальным (вытянутым вдоль оси X). И наоборот, когда флуорофор находится ниже средней фокальной плоскости, функция рассеяния точки оказывается вытянутой вдоль оси Y. Анализируя форму полученных изображений, можно установить не только координаты флуорофора по осям X и Y, но и однозначно определить положение относительно оси Z (рис. 6) .

Дифракционный предел преодолен!

И, наконец, необходимо сказать, что недавно физики открыли способ непосредственно преодолеть дифракционный предел. Для этого необходимо сконструировать микроскоп с линзами из метаматериала - материала с отрицательным коэффициентом преломления. Веществ с такими свойствами в природе не обнаружено, их можно получить только искусственным путем в лаборатории. Существование таких веществ было предсказано еще 40 лет назад советским физиком Виктором Веселаго , а созданы они были только в 2000-х годах. Так, отрицательный коэффициент преломления означает, что преломленный луч в среде с отрицательным коэффициентом находится с той же стороны, что и падающий (обычно падающий и преломленный лучи находятся с разных сторон от нормали, поведенной к границе раздела сред). Поэтому плоский брусок такого материала может выполнять роль суперлинзы, позволяющей различить детали по размерам меньшие полудлины волны .

Литература

1. Википедия: «Оптический микроскоп »;
2. Сердюк И., Заккаи Н., Заккаи Дж. Методы в молекулярной биофизике: структура, функция, динамика. Изд. КДУ, 2010;
3. Штейн Г.И. Руководство по конфокальной микроскопии. Изд. ИНЦ РАН, 2007;
4. Hell S.W., Dyba M., Jakobs S. (2004). Concepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy . Curr. Opin. Neurobiol. 14, 599–609; ;
5. Egner A., Hell S.W. (2005). Fluorescence microscopy with super-resolved optical sections . Trends Cell Biol. 15, 207–215; ;
6. Huang B., Bates M., Zhuang X. (2009). Super-Resolution Fluorescence Microscopy . Ann. Rev. Biochem. 78, 993–1016; ;
7. Феофанов А.В. (2007). Cпектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях. Успехи биол. химии 47, 371–410; ;
»..

2. Оптическая система микроскопа.

3. Увеличение микроскопа.

4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа.

5. Полезное увеличение микроскопа.

6. Специальные приемы микроскопии.

7. Основные понятия и формулы.

8. Задачи.

Способность глаза различать мелкие детали предмета зависит от размеров изображения на сетчатке или от угла зрения. Для увеличения угла зрения используют специальные оптические приборы.

25.1. Лупа

Простейшим оптическим прибором для увеличения угла зрения является лупа, представляющая собой короткофокусную собирающую линзу (f = 1-10 см).

Рассматриваемый предмет помещают между лупой и ее передним фокусом с таким расчетом, чтобы его мнимое изображение находилось в пределах аккомодации для данного глаза. Обычно используют плоскости дальней или ближней аккомодации. Последний случай предпочтительнее, так как глаз не утомляется (кольцевая мышца не напряжена).

Сравним углы зрения, под которыми виден предмет, рассматриваемый «невооруженным» нормальным глазом и с помощью лупы. Расчеты выполним для случая, когда мнимое изображение предмета получается на бесконечности (дальний предел аккомодации).

При рассматривании предмета невооруженным глазом (рис. 25.1, а) для получения максимального угла зрения предмет нужно поместить на расстояние наилучшего зрения а 0 . Угол зрения, под которым при этом виден предмет, равен β = В/а 0 (В - размер предмета).

При рассматривании предмета с помощью лупы (рис. 25.1, б) его помещают в передней фокальной плоскости лупы. При этом глаз видит мнимое изображение предмета В", расположенное в бесконечно удаленной плоскости. Угол зрения, под которым видно изображение, равен β" ≈ В/f.

Рис. 25.1. Углы зрения: а - невооруженным глазом; б - с помощью лупы: f - фокусное расстояние лупы; N - узловая точка глаза

Увеличение лупы - отношение угла зрения β", под которым видно изображение предмета в лупе, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» нормальным глазом с расстояния наилучшего зрения:

Увеличения лупы для близорукого и дальнозоркого глаза разные, так как у них различны расстояния наилучшего зрения.

Приведем без вывода формулу для увеличения, которое дает лупа, используемая близоруким или дальнозорким глазом при формировании изображения в плоскости дальней аккомодации:

где а даль - дальний предел аккомодации.

Формула (25.1) позволяет предположить, что, уменьшая фокусное расстояние лупы, можно добиться сколь угодно большого увеличения. В принципе это так. Однако при уменьшении фокусного расстояния лупы и сохранении ее размеров возникают такие аберрации, которые сводят на нет весь эффект увеличения. Поэтому однолинзовые лупы обычно имеют 5-7-кратное увеличение.

Для уменьшения аберраций изготавливают сложные лупы, состоящие из двух-трех линз. В этом случае удается добиться 50-кратного увеличения.

25.2. Оптическая система микроскопа

Большее увеличение можно осуществить, рассматривая при помощи лупы действительное изображение предмета, создаваемое другой линзой или системой линз. Такое оптическое устройство реализовано в микроскопе. Лупу в этом случае называют окуляром, а другую линзу - объективом. Ход лучей в микроскопе показан на рис. 25.2.

Предмет В помещается вблизи переднего фокуса объектива (F об) с таким расчетом, чтобы его действительное, увеличенное изображение B" находилось между окуляром и его передним фокусом. При

Рис. 25.2. Ход лучей в микроскопе.

этом окуляр дает мнимое увеличенное изображение B", которое и рассматривает глаз.

Изменяя расстояние между предметом и объективом, добиваются того, чтобы изображение В" оказалось в плоскости дальней аккомодации глаза (в этом случае глаз не утомляется). Для человека с нормальным зрением В" располагается в фокальной плоскости окуляра, а В" получается на бесконечности.

25.3. Увеличение микроскопа

Основной характеристикой микроскопа является его угловое увеличение. Это понятие аналогично угловому увеличению лупы.

Увеличение микроскопа - отношение угла зрения β", под которым видно изображение предмета в окуляре, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» глазом с расстояния наилучшего зрения (а 0):

25.4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа

Может сложиться впечатление, что, увеличивая оптическую длину тубуса, можно добиться сколь угодно большого увеличения и, следовательно, рассмотреть самые мелкие детали предмета.

Однако учет волновых свойств света показывает, что на размеры мелких деталей, различимых с помощью микроскопа, накладываются ограничения, связанные с дифракцией света, проходящего через отверстие объектива. Вследствие дифракции изображением освещенной точки оказывается не точка, а небольшой светлый кружок. Если рассматриваемые детали (точки) предмета расположены достаточно далеко, то объектив даст их изображения в виде двух отдельных кружков и их можно различить (рис. 25.3, а). Наименьшему расстоянию между различимыми точками соответствует «касание» кружков (рис. 25.3, б). Если точки расположены очень близко, то соответствующие им «кружки» перекрываются и воспринимаются как один объект (рис. 25.3, в).

Рис. 25.3. Разрешающая способность

Основной характеристикой, показывающей возможности микроскопа в этом отношении, является предел разрешения.

Предел разрешения микроскопа (Z) - наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они различимы как отдельные объекты (т.е. воспринимаются в микроскопе как две точки).

Величина, обратная пределу разрешения, называется разрешающей способностью. Чем меньше предел разрешения, тем больше разрешающая способность.

Теоретический предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света, используемого для освещения, и от угловой апертуры объектива.

Угловая апертура (u) - угол между крайними лучами светового пучка, входящего в линзу объектива от предмета.

Укажем без вывода формулу для предела разрешения микроскопа в воздушной среде:

где λ - длина волны света, которым освещается объект.

У современных микроскопов угловая апертура достигает 140°. Если принять λ = 0,555 мкм, то получим для предела разрешения значение Z = 0,3 мкм.

25.5. Полезное увеличение микроскопа

Выясним, насколько большим должно быть увеличение микроскопа при заданном пределе разрешения его объектива. Примем во внимание, что у глаза имеется собственный предел разрешения, обусловленный строением сетчатки. В лекции 24 мы получили следующую оценку для предела разрешения глаза: Z ГЛ = 145-290 мкм. Для того чтобы глаз мог различить те же точки, которые разделяет микроскоп, необходимо увеличение

Это увеличение называют полезным увеличением.

Отметим, что при использовании микроскопа для фотографирования объекта в формуле (25.4) вместо Z ГЛ следует использовать предел разрешения пленки Z ПЛ.

Полезное увеличение микроскопа - увеличение, при котором предмет, имеющий размер, равный пределу разрешения микроскопа, имеет изображение, размер которого равен пределу разрешения глаза.

Используя полученную выше оценку для предела разрешения микроскопа Z м ≈0,3 мкм), найдем: Г п ~500-1000.

Добиваться большего значения для увеличения микроскопа не имеет смысла, так как никаких дополнительных деталей увидеть все равно не удастся.

Полезное увеличение микроскопа - это разумное сочетание разрешающих способностей и микроскопа, и глаза.

25.6. Специальные приемы микроскопии

Специальные приемы микроскопии используются для увеличения разрешающей способности (уменьшения предела разрешения) микроскопа.

1. Иммерсия. В некоторых микроскопах для уменьшения предела разрешения пространство между объективом и предметом заполняют специальной жидкостью - иммерсией. Такой микроскоп называют иммерсионным. Эффект иммерсии заключается в уменьшении длины волны: λ = λ 0 /n, где λ 0 - длина световой волны в вакууме, а n - показатель преломления иммерсии. В этом случае предел разрешения микроскопа определяется следующей формулой (обобщение формулы (25.3)):

Отметим, что для иммерсионных микроскопов создают специальные объективы, так как в жидкой среде изменяется фокусное расстояние объектива.

2. УФ-микроскопия. Для уменьшения предела разрешения используют коротковолновое ультрафиолетовое излучение, невидимое глазом. В ультрафиолетовых микроскопах микрообъект исследуется в УФлучах (в этом случае линзы выполняются из кварцевого стекла, а регистрация ведется на фотопленке или на специальном люминесцентном экране).

3. Измерение размеров микроскопических объектов. С помощью микроскопа можно определить размеры наблюдаемого объекта. Для этого применяют окулярный микрометр. Простейший окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения, получаемого от объектива. При рассматривании в окуляр изображения объекта и шкалы сливаются, можно отсчитать, какое расстояние по шкале соответствует измеряемой величине. Предварительно определяют по известному объекту цену деления окулярного микрометра.

4. Микропроекция и микрофотография. С помощью микроскопа можно не только наблюдать объект через окуляр, но и фотографировать его или проецировать на экран. В этом случае применяют специальные окуляры, которые и проецируют промежуточное изображение A"B" на пленку или на экран.

5. Ультрамикроскопия. Микроскоп позволяет обнаружить частицы, размеры которых лежат за пределами его разрешения. Этот метод использует косое освещение, благодаря чему микрочастицы видны как светлые точки на темном фоне, при этом строение частиц увидеть нельзя, можно только установить факт их наличия.

Теория показывает, что, как бы силен не был микроскоп, всякий предмет размерами меньше 3 мкм будет представляться в нем просто как одна точка, без всяких подробностей. Но это не означает, что такие частицы нельзя видеть, следить за их движениями или считать их.

Для наблюдения частиц, размеры которых меньше предела разрешения микроскопа, служит приспособление, называемое ультрамикроскоп. Главную часть ультрамикроскопа составляет сильное осветительное приспособление; освещенные таким образом частицы наблюдаются в обыкновенном микроскопе. Ультрамикроскопия основана на том, что мелкие частицы, взвешенные в жидкости или газе, делаются видимыми при сильном боковом освещении (вспомним пылинки, видимые в солнечном луче).

25.8. Основные понятия и формулы

Окончание таблицы

25.8. Задачи

1. Линза с фокусным расстоянием 0,8 см используется в качестве объектива микроскопа с фокусным расстоянием окуляра, равным 2 см. Оптическая длина тубуса равна 18 см. Каково увеличение микроскопа?

2. Определить предел разрешения сухого и иммерсионного (n = 1,55) объективов c угловой апертурой u = 140 о. Длину волны принять равной 0,555 мкм.

3. Чему равен предел разрешения на длине волны λ = 0,555 мкм, если числовая апертура равна: А 1 = 0,25, А 2 = 0,65?

4. С каким показателем преломления следует взять иммерсионную жидкость, чтобы рассмотреть в микроскопе субклеточный элемент диаметром 0,25 мкм при наблюдении через оранжевый светофильтр (длина волны 600 нм)? Апертурный угол микроскопа 70°.

5. На ободке лупы имеется надпись «х10» Определить фокусное расстояние этой лупы.

6. Фокусное расстояние объектива микроскопа f 1 = 0,3 см, длина тубуса Δ = 15 см, увеличение Г = 2500. Найти фокусное расстояние F 2 окуляра. Расстояние наилучшего зрения a 0 = 25 см.